几种皮肤美白剂的功效评价

宋琦如, 金锡鹏, 沈光祖
摘要: 为评价常用皮肤美白剂的美白效果, 我们采用B - 16 黑色素瘤细胞株为受试细胞, 对熊果苷、曲酸、甘草提取物和Vc 衍生物等4 种常用皮肤美白剂的功效进行测定。结果显示: 4 种美白剂(10μg/ mL , 30μg/mL , 50μg/ mL , 70μg/ mL , 100μg/ mL) 可明显抑制细胞生长(P < 0101) , 使黑色素细胞中黑色素含量明显降低(P < 0101) , 改变细胞形态, 但对细胞中酪氨酸酶活性抑制不明显(P > 0105) 。提示: 4 种皮肤美白剂均具有一定的美白效果, 其机制可能与酪氨酸酶活性改变的关系不大。在皮肤美白剂功效评价中应重视细胞中黑色素含量的测定。
关键词: 化妆品; 皮肤美白剂; B - 16 黑色素瘤细胞; 功效评价
　　人类崇尚美, 而女性更加期望皮肤美, 亚洲妇女尤其注重皮肤的白皙美。世界上著名的化妆品公司都投入人力物力进行皮肤美白有效成分的研究开发, 目前已有许多皮肤美白剂问世, 如早期的纯化学物氢醌、中期的果酸及组织提取物胎盘膏和近期的天然植物提取物- 熊果苷、Vc 衍生物及甘草提取物等。这些皮肤美白剂的问世, 在一定程度上满足了广大消费者的需求, 刺激了美白化妆品市场的发展。但是我们也应清醒地认识到, 纯化学物的美白效果较好, 但副作用较大, 纯天然植物提取物副作用虽小, 但美白效果或小或不肯定, 化妆品生产厂家和广大消费者无法得到美白化妆品真实效果评价的资料, 只能听信美白剂研发者的说辞和广告宣传, 而美白剂研发者只进行了初步的美白效果临床观察, 很难有客观确切的数据, 因此无法提供可靠的美白剂功效及毒性信息, 长此以往必将对美白化妆品市场的健康发展产生负面影响。为此本实验室对市售皮肤美白化妆品常用有效成分, 进行了较为全面的功效及毒性测试。
1 　材料与方法
11 　试剂与仪器
111 　试剂
        0．15 %脱氧胆酸钠溶液(质量分数) , 蒸馏水配制; 011 %L - DOPA 溶液(质量分数) , 每次用011mol/L 磷酸缓冲液新鲜配制; 0125 %胰酶溶液(质量分数) ; 1 mol/ L 氢氧化钠溶液; 1 640 培养液; 熊果苷溶液、曲酸溶液、Vc 衍生物溶液和甘草提取物溶液(以上溶液均为实验用纯净水配制) , 中科院生化所提供; 011 mol/ L 磷酸盐缓冲液(PBS) 。11112 　仪器普通离心机(转速为1 000 r/ min～10 000 r/ min) ;7230 G分光光度计(上海分析仪器厂) ; 37 ℃电热恒温水浴锅。
112 　细胞培养
        B - 16 黑色素瘤细胞株(中科院细胞所) 。待细胞生长至亚融合状态, 经0125 %胰蛋白酶消化传代,用1 640 培养液, 置于CO2 培养箱37 ℃, 5 %CO2 ,饱和湿度环境进行培养。每一次实验取自同一传代细胞, 初始接种细胞密度为105 左右。细胞接种2 h 后,添加受试美白剂(各设5 个剂量组: 10 μg/ mL 、30μg/ mL 、50μg/ mL 、70μg/ mL 、100μg/ mL) , 于第3 d换培养液和受试美白剂, 连续培养5 d 后收获细胞,用台盼兰染色计数细胞总数, 然后将细胞分为2 份分别用于酪氨酸酶活性和黑色素含量测定。
113 　酪氨酸酶活性和黑色素含量测定
        将培养到期的各组细胞经质量分数为0125 %胰蛋白酶消化离心后, 用PBS 缓冲液清洗离心2 次, 再用PBS 缓冲液将沉淀细胞吹打成悬液计数后备用。
        酪氨酸酶活性是根据多巴向多巴醌氧化的速度确定的。本室参照Hideya Ando 等的方法[1 ] , 建立了改进的酪氨酸酶活性测定方法。取备用细胞悬液加PBS缓冲液调节细胞密度在104 左右(本实验室发现如果细胞密度过高, 会影响细胞崩解产物与L - DOPA 的充分混匀, 从而影响酪氨酸酶活性的测定) , 各吸取1 mL 细胞悬液分别置于3 个平行试管中, 离心后弃去上清液, 加入1 mL 质量分数为015 %脱氧胆酸钠溶液, 并充分振摇使细胞溶解, 将试管置于0 ℃15min , 再置于37 ℃水浴10 min , 即刻加入质量分数为011 %L - DOPA 溶液, 振摇后在分光光度计475 nm处, 分别于0 min 和10 min 时读取吸光度值, 计算两个时段的吸光度值的差值, 并除以细胞数, 作为评价酪氨酸酶活性高低的指标。
        参照Hideya Ando 等提出的方法, 经一定改进后进行黑色素含量测定。取备用细胞悬液加PBS 缓冲液调节细胞密度至104 左右, 各吸取1 mL 细胞悬液分别置于3 个平行具塞比色管中, 离心后弃去上清液, 先加入200μL 蒸馏水使细胞重新悬浮, 然后加入1 mL1∶1 乙醇乙醚液以溶解非黑色素的不透明颗粒, 在室温下放置15 min , 离心并弃去上清液, 加入1 mL 质量分数为10 %二甲基亚砜1 mol/ L NaOH 溶液, 置于80 ℃水浴30 min , 于470 nm 处测定吸光度值, 将吸光度值除以胞数, 作为评价黑色素含量大小的指标。
114 　数据处理
        
使用Excel 软件对数据进行方差分析和趋势检验。
2 　结果
211 　几种美白剂对细胞数量的影响(图1)


图1 　常用美白剂对细胞数量的影响
Fig. 1 　Effect of cell number by skin lighters
        从图1 可见, 随着剂量的增加, 细胞数量明显减少, 与对照组比较具有明显差异(P < 0101) , 并呈现剂量- 效应关系。
212 　几种美白剂对细胞黑色素含量的作用(图2)


图2 　常用美白剂对黑素含量的影响
Fig. 2 　Effect of melanin content by skin lighters
        从图2 可见, 几种常用美白剂对细胞黑色素量的合成, 均有十分明显的抑制作用(P < 0101) , 并呈现良好的剂量- 效应关系。
213 　几种美白剂对黑色素细胞中酪氨酸酶活性的影响(图3)


图3 　常用美白剂对酪氨酸酶活性的影响Fig. 3 　Effect of tyrosinase activity by skin lighters
        由图3 可见, 几种美白剂对酪氨酸酶活性抑制不明显(P > 0105) , 除甘草提取物外, 黑色素细胞中酪氨酸酶活性呈波动性变化。
214 　几种美白剂对黑色素细胞形态的影响(图4)


对照熊果苷曲酸甘草Vc
图4 　细胞形态变化
Fig. 4 　Morphorlogical change by skin lighters
　　从图4 可见, 对照组细胞生长良好, 形态正常,而加入4 种美白剂后(50μg/ mL) , 均可导致细胞分布稀疏, 细胞树突减少或消失, 不能相互融合形成网状结构。
3 　讨论
        由于女性对皮肤白皙的崇尚, 使美白化妆品的消费不断增加。化妆品研究机构及生产厂商为满足需要投入大量的人力物力进行美白剂的开发, 目前已有多种皮肤美白剂投入使用。但是研究生产投资者为尽快获得效益, 缩短研究- 投产周期, 使得一些美白剂的功效及毒性评价不够全面和细致。我国基本是照搬国外的资料, 进行美白剂的生产, 没有进行较为全面的功效评价, 更未见利用培养皮肤细胞较全面进行美白剂功效评价的文献报道。
        B - 16 黑色素瘤细胞株的基本结构, 特别是黑色素合成功能与人正常的皮肤黑色素细胞基本一致, 在人体原代皮肤黑色素细胞培养非常困难的情况下, 国外化妆品生产企业的科研单位, 在筛选美白剂的过程中, 广泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。为此我们采用B - 16 黑色素瘤细胞株, 对4种常用皮肤美白剂的功效进行检测, 为我国美白剂的研究生产提供一些参考信息。
        通过对4 种常用美白剂检测, 结果显示: 熊果苷、曲酸、甘草和Vc 衍生物可干扰细胞增殖周期使细胞生长受到抑制。随着剂量的增加, 细胞数量明显减少(P < 0101) , 从图4 可见细胞生长状况, 在美白剂作用下, 细胞呈散在性分布, 许多细胞孤立存在, 细胞树状突起减少、缩短, 细胞之间很难形成互相维持的网状结构, 导致细胞不能通过网状互联结构进行旁分泌和细胞间隙通讯, 以达到共同增殖分化,实现细胞正常生理功能。
        图2 显示, 4 种美白剂可抑制细胞合成黑色素,使细胞内黑色素含量明显降低(P < 0101) , 并呈现剂量- 效应关系, 表明此4 种美白剂不但可使细胞生长减缓, 同时可抑制皮肤细胞黑色素的合成水平, 使每个细胞中的黑色素含量降低, 达到了双重调控的目的。结合细胞数量及黑色素含量结果, 以熊果苷和甘草提取物的抑制效果较为明显, 这与有关报道一致[2 ] 。从图3 可以看出, 4 种美白剂对细胞中酪氨酸酶活性抑制不明显(P > 0105) , 随剂量变化细胞内酪氨酸酶活性呈现波动性变化。表明4 种美白剂抑制黑色素合成可能与黑色素合成中的多个酶有关, 也可能通过其他途径干预细胞黑色素合成功能。MitshnariNakajima 等研究发现, 熊果苷抑制细胞合成黑色素,对细胞酪氨酸酶活性没有明显影响, 提出熊果苷可能是通过非酪氨酸酶途径抑制黑色素合成[3 ] , 表明美白剂作用机制的复杂性。
        本次研究结果提示, 4 种皮肤美白剂均可抑制细胞生长和黑色素合成, 具有一定的美白效果。4 种皮肤美白剂对调控黑色素合成的关键酶之一———酪氨酸酶抑制均不明显, 提示细胞黑色素合成是通过多酶和多途径进行的, 同时应对以酪氨酸酶活性高低作为美白剂功效的评价体系提出质疑。我们认为, 以细胞中黑色素含量的变化, 作为评判美白剂美白效果的最终指标可能更为合适和重要。