高分子量透明质酸的发酵研究

田毅红，蔡海波，陆仕灿，谭文松*，许建和
摘要：采用兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)进行分批补料发酵生产透明质酸(HA)。结果表明：采用葡萄糖初始浓度为4％，分批补加葡萄糖，使其浓度控制在2％，可使HA 的产量达到3.4g/L，平均分子量2.45 × 106Da。若加入0.75g/L 尿苷一磷酸，HA 的产量可提高20.6％，达4.1g/L，平均分子量2.87 × 106Da。
关键词：透明质酸；分批补料发酵；兽疫链球菌
        透明质酸(hyaluronic acid，HA，1)是由N- 乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcUA)为双糖单位聚合而成的酸性高分子粘多糖，具有良好的保湿性和黏弹性，可用于制备化妆品。高分子量的1具有较高的黏弹性，在眼科手术中可作为填充剂，具有良好的市场前景。本文以兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)发酵制备1，考察了发酵初始和培养过程中葡萄糖浓度及添加尿苷一磷酸(UMP)对1 发酵的影响，初步优化了1 的发酵条件，产量和分子量都得以提高。
1 材料与方法
1.1 菌种和培养基
菌种：兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus(本实验室保存)。
斜面培养基/％：葡萄糖0.2，牛肉膏1.0，蛋白胨2.0，
酵母抽提物 0.5，NaCl 0.2，Na2HPO4•12H2O 0.1，KH2PO4
0.012，琼脂2.0；pH7.0～7.2。
种子培养基/ ％：同斜面培养基，不加琼脂。
发酵培养基/ ％：蛋白胨 2 .0 ，酵母抽提物 1 .0 ，
MgSO4•7H2O 0.1，K2HPO4 0.25，NaCl 0.2；pH7.0～7.2。
葡萄糖配成50％的水溶液，单独灭菌。
1.2 培养方法
斜面培养：37℃培养24h。
种子培养：摇瓶于37℃培养8h。
发酵培养：5L全自动发酵罐(华东理工大学)中装液2.5L。罐温37℃，pH 7.0，通气量2.4L/min，初始搅拌转速150r/min，然后逐渐提高到600r/min，接种量5％。pH 用6mol/L NaOH 溶液自动调节。
1.3 测定方法
菌体浓度：660nm 处测定吸收度A。
葡萄糖含量测定：3,5- 二硝基水杨酸法[ 1]。
1 含量测定：按文献[2]操作，以葡萄糖醛酸内酯为对照品。
1 分子量的测定[ 3 ]：用毛细管直径为0 . 7 ～0.8mm 的乌式黏度计于25℃测定黏度，参比液为0.2mol/L NaCl 溶液，三点外推计算出特性黏度，根据公式＝ 0.036M0.78 计算1 的分子量M。
2 结果与讨论
2.1 1的分批发酵首先进行1 的分批发酵实验。接种时加入7％的葡萄糖，结果如图1 所示。

        由图1 可见，培养4h 后菌体进入对数生长期，到9h 时对数生长期结束，A660 约为7.0；葡萄糖在对数生长期的中后期(7～8h)消耗迅速，说明菌体对碳源的需求最大；12h 时葡萄糖浓度接近1％，且菌体浓度有所下降，表明菌体处于碳源限制状态。进入生长稳定期，1 的产量和分子量逐渐增大，但由于发酵后期葡萄糖浓度较低，不利于产物合成，1产量增加较小，最高为2.73g/L，最大分子量2.37 ×106Da 。
        可见，发酵后期由于葡萄糖浓度较低，对菌体的生长(维持)和产物合成都产生了不利影响。因此，我们进行了分批补料发酵试验，力求提高1的产量和分子量。
2.2 1的分批补料发酵
2.2.1 葡萄糖浓度对1发酵的影响
        从摇瓶结果发现，初始葡萄糖浓度较低，菌体生长较快，但1 分子量较低；而提高葡萄糖初始浓度，虽不利于菌体的生长，但能提高1 的分子量。为此设计了分批补料发酵的方案，葡萄糖初始浓度为2％，在发酵过程中分批补入浓度为50％的葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为1％，通气量为2.4 L/min。结果见图2 。

        由图2 可见，菌体生长从3h 进入对数生长期，从5h 起葡萄糖迅速消耗，因此从6h 开始先补足葡萄糖至2％，以后每小时补足葡萄糖并维持在1％。
        从6h 开始，1 产量增加，明显高于分批发酵，13h 时1 的产量最大，达3.74g/L，较分批发酵相比提高了3 7 ％；1 的分子量也到达最大，为2 . 1 ×106Da。发酵结束时，发酵液非常粘稠，几乎无流动性，即使增加搅拌转速，或增大通气量，也只有搅拌桨周围的圆柱形区域搅拌良好，而其余部分几乎静止不动，即存在无效搅拌区域[4]。这种情况可能是制约1产量和进一步提高分子量的主要原因之一。
        可见，当初始葡萄糖浓度较低时有利于菌体的生长，但较低的葡萄糖浓度会造成1 合成前体和能量的供应不足，较早地终止1 分子链的延伸，不利于分子量增加。为此，本文采用不同的初始葡萄糖浓度，在培养过程中维持不同糖浓度的分批补料发酵试验，以期在提高产量的同时也提高1 的分子量。
结果见表1 。
表1 不同葡萄糖初始浓度下1的分批补料发酵结果

        由表1 可知，当葡萄糖初始浓度2％时，菌体生长较快，最大比生长速度max 较大，A660 较高，可达7.5～8.0，1 最大产量3.7g/L；当葡萄糖初始浓度6％时，菌体的生长相对较慢[max ＝(0.88 ±0.02)h-1]，A660 较低，仅6.5～7.0，1 的最大产量3.3～3.4g/L。可见葡萄糖初始浓度低时，菌体生长情况较好，1 的产量也较高，表明菌体生长与产物合成是相关联的；而提高葡萄糖初始浓度，有利于获得高分子量的1 ，但产量却有所下降。
        由于1 产量与分子量呈反比，而1 分子量越大，药用价值越高。综合考虑，选用葡萄糖初始浓度4％，补加葡萄糖维持浓度2％为最优条件，1 产量达3.4g/L，平均分子量2.45 × 106Da。
        较高的葡萄糖初始浓度有利于1 分子量的提高，原因在于构成1的GlcNAc和GlcUA均系由葡萄糖分子衍生而来，葡萄糖是1多聚物的一个必需构建单元，同时也是菌体生长的能源。UDP(尿苷二磷酸)-GlcUA 和UDP-GlcNAc 是合成1 的前体，后者也是合成菌体细胞壁的前体。在高初始葡萄糖浓度下，单体UDP-GlcUA 和UDP-GlcNAc 被激活，外部的葡萄糖连接到这些单体上，使1 链延长；同时葡萄糖的高初始浓度可以提供充足的能量，有利于1的合成，故得到的1 分子量较高[ 5] 。
2.2.2 加入尿苷一磷酸(UMP)对发酵的影响
        链球菌是一种营养要求复杂的菌种。鉴于UDPGlcUA和UDP-GlcNAc 是合成1 的前体，补充一定的UMP 对1 的合成应该有促进作用[6]。
        接种时加入0.75g/L 的UMP，结果发现，1 产量有显著提高。加与不加UMP 的发酵结果比较见表2。
表2 加入UMP对1 发酵的影响

        可见加入UMP 确可明显提高1 的产量。在葡萄糖低初始浓度下，产量提高了21.6％，分子量无明显变化；但在葡萄糖高初始浓度下，产量提高了20.6％，分子量比对照组有较大提高。产量提高的原因可能是由于链球菌的三羧酸循环不完全[5]，外源UMP的加入为1 的合成提供了前体，并直接参与1合成的次级代谢反应，从而促进1的产量和分子量提高。
3 结论
        分批补料发酵可以充分利用菌体对1 的合成能力，提高1 的产量。与分批发酵相比，本文所用方法产量可提高2 5 ％左右。若在接种时添加外源UMP，1 产量可达4.1g/L，分子量2.87 × 106Da。