碱提法提取燕麦麸皮蛋白工艺条件的优化

摘要：本文以燕麦麸皮为原料，通过碱提工艺提取燕麦麸皮蛋白，并优化了实验室提取条件。在碱法水解蛋白工艺中，以水解温度、时间、加碱量为单因素考察，并运用甲醛滴定法对燕麦蛋白的水解度进行测定。结果表明：料液比为1:20，反应时间为2h，溶液含碱量1mol/L时为最佳提取工艺，该工艺的水解度大约为30％左右；通过凝胶色谱分析了水解物的分子量变化情况，在最佳生产工艺条件下，水解产物主要是对应分子量为31500Da和100－200Da的物质。

关键词 燕麦麸；燕麦麸蛋白；碱法水解

植物水解蛋白质含有人体所需要的氨基酸等多种营养成分[1]。燕麦麸是燕麦加工过程中的副产物，含有大量的蛋白质和膳食纤维[2]。目前国内外对燕麦麸的研究热点主要集中在膳食纤维上，而有关燕麦麸蛋白的研究很少[3，4]。本试验采用燕麦麸为原料提取了燕麦麸分离蛋白，并利用碱法水解对其进行改性，考察了不同水解度对蛋白质分子结构及功能性质的影响，为以后燕麦蛋白的更好利用提供了一些理论依据[5，6]。
1. 实验材料与方法
1.1原料
燕麦麸皮，张家口面粉厂提供
1.2仪器
DSHZ-300型多用途水浴恒温振荡器——江苏太仓实验设备厂；T6新世纪紫外可见分光光度计——北京普析通用仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1燕麦蛋白水解液中成分分析
蛋白质水解度的测定:甲醛滴定法[7]
所谓蛋白质的水解度(Degree of hydrolysis，DH)是指蛋白质中的肽键被水解的百分数，其计算公式为:
DH%=h/htot×100%
其中，h即是蛋白质水解后每克蛋白中被裂解的肽键的毫摩尔数(mmol/g蛋白质)，而htot则是指每克原料蛋白中肽键的毫摩尔数。对于某一特定的蛋白质，该值是一个常数。但由于蛋白质中的肽键的数目没法精确的测出，而且不同的蛋白质其肽键的含量也不同。因此，一般根据文献取一个经验值。
1.3.2碱提法制备燕麦蛋白水解液
在料水比为1：20时，即称取20-60目过筛的燕麦麸皮5g，量取100ml蒸馏水，加入500mL的圆底烧瓶中。后加入0.05mLβ-葡聚糖酶在60℃水浴中充分反应30min，再加入1mL高温α-淀粉酶，在80℃下反应30min，取出几滴水解液用淀粉KI溶液检测，直至溶液不显示蓝色，表明淀粉已除净。接着按溶液中碱含量为1mol/L加入4gNaOH固体，用玻璃棒充分搅拌后再在80℃水浴下继续反应2h，随后在10000r/min条件下离心20min，收集上清液即为燕麦蛋白水解液。
1.3.3燕麦麸皮水解蛋白提取工艺参数单因素试验方法
1）水解时间对水解蛋白质工艺的影响
    以蛋白质水解度为指标，设定水解时间分别为0.5、1.5、2.0、3.0、5.0h，同时将料液比和温度分别控制在1：20和80℃，接着按溶液中碱含量为1mol/L的条件进行水解反应，后在10000r/min的条件下离心20min，取上清液测水解度。
2）水解温度对水解蛋白工艺的影响
以水解度为指标，设定水浴温度分别为60、70、80、90、100℃，同时控制料液比为1：20，溶液中碱含量为1mol/L反应，水浴反应 2h后在10000r/min的条件下离心20min，取上清液测水解度。
3）加碱量对水解蛋白工艺的影响
以水解度为指标，按溶液中NaOH含量分别为0.5、1.0、3.0、4.0、5.0mol/L，同时料液比控制在1：20和80℃，水浴反应2h后在10000r/min的条件下离心20min，取上清液测水解度。
1.3.4 凝胶层析色谱法分析蛋白水解液分子量分布状况
1） 柱条件∶
1）色谱柱∶φ1.5×60 cm；2）凝胶∶Sephadex G-25 Fine； 3）上样量∶5 mL；4）上样流速∶0.8 mL/min； 5）定时收集∶5 min/管。
2） 操作方法∶
制作标准曲线，后将燕麦水解液进行凝胶层析，制作洗脱体积-蛋白吸光度值曲线，用紫外分光光度计逐管测定其吸光度A280，并确定各水解液的洗脱峰最高点，然后量出其洗脱体积。
2.结果与分析
2.1碱法水解燕麦蛋白单因素试验结果
2.1.1水解时间对碱法水解的影响
实验选择不同的反应时间：0.5、1.0、2.0、3.0、5.0h进行实验，进而检测水解度变化情况，实验结果如图1。
 
图1 时间对碱解蛋白水解率的影响
由图1可知，随着时间的延长水解度不断升高，而且在1-3h间水解度增加的趋势较快，3-4h水解度增加十分缓慢。可能是由于反应温度和碱液浓度的限制，当反应3h时已经达到很高的程度，而这时即使水解时间增加，水解效果也不再明显升高了。而从生产效率考虑，当水解度达到一定程度时，即可终止反应。实验中当水解时间为2h时，水解度已达到34.59%，因此确定水解时间为2h。
2.1.2水解反应温度对碱法水解的影响
实验选择不同的反应温度即60、70、80、90、100℃进行实验，进而检测水解度变化情况，实验结果如图2。
 
图2 温度对碱解蛋白水解率的影响
由图2可知，随着温度的升高，水解度呈一路上升趋势。可见，提高温度对水解的影响较明显。在加碱量同样的条件下，可以通过提高温度和延长水解时间来提高水解度。而温度过高，不利于生产中过程控制，而当温度达到80℃时，水解度已达到34.48%，因此，将实验中反应温度定为80℃。
2.1.3 水解液中加碱量对碱法水解的影响
实验按溶液中NaOH含量分别为0.5、1.0、3.0、4.0、5.0mol/L进行实验，检测水解度变化情况，实验结果如图3。
 
图3 碱浓度对碱解蛋白水解率的影响
由图3可知，在本试验设定的试验范围内，氢氧化钠浓度越高，则水解度越大。但水解度的升高与碱液浓度的增加不成倍数关系，在0.5-1mol/L，3-4mol/L范围增加较快，1-3mol/L范围直线较平缓，也就是说浓度的增加对水解度的升高效果不十分明显。而生产中，见浓度的增加会使生产设备的损耗加剧，要适当控制碱浓度。而实验中，当NaOH浓度为1mol/L时，水解度达到32.33%，因此选取NaOH浓度为1mol/L。
2.1.4实验条件的选择
     根据单因素实验结果，可以确定制备燕麦蛋白水解液的工艺路线：1）料液比：1：20；2）水解时间：2h；3）水解温度：80℃；4）水解液中NaOH含量：1mol/L。
由于燕麦中含有大量的β-葡聚糖，而根据其物理性质，大量的β-葡聚糖存在会使水解液黏度增加，因此加入一定量β-葡聚糖酶，水解β-葡聚糖。另外，燕麦中含有大量的淀粉而影响水解液口感，于是在水解液中加入一定量高温α-淀粉酶。
按以上生产工艺，最终燕麦蛋白水解液中蛋白质水解度达到30%。
2.2燕麦水解物分子量的测定结果
2.2.1 燕麦水解物的紫外扫描结果
 
图4 燕麦水解产物的紫外扫描结果
由图4可知，燕麦的水解物在紫外区有明显的吸收，特别是在230nm和280nm处，有两个吸收高峰出现，虽然230nm下的紫外吸收峰更高，但从文献知，在280nm下测得的蛋白含量已经很准确。所以，本实验中用凝胶色谱法测燕麦肽的分子量时，通过测所收集组分的280nm处的吸光度值做洗脱图谱，便能达到精确的结果。
2.2.2标准曲线的制定
将已知分子量的标准品物质牛血清白蛋白、牛胰岛素、氧化型谷胱甘肽、及维生素B12分别配成1%的溶液，经微孔滤膜过滤后分别进样3mL。
以分子量的对数为纵坐标，洗脱体积为横坐标，做出标准曲线如图5所示：
 
图5 分子量对数与洗脱体积关系图
由图5可知，采用最小二乘法，求出直线的回归方程为：Y= -0.0298X+7.1547，其回归系数R2=0.999，式中X代表洗脱体积，Y代表分子量对数。采用该回归方程可以根据某物质的洗脱体积估算出该物质的分子量。
2.2.3碱法水解燕麦麸皮蛋白水解物的凝胶层析
 
图6  0.5h、2h、4h蛋白水解物分子量曲线图
图6代表碱解蛋白作用不同时间后，水解产物经Sephadex G-25型凝胶柱层析所得到的洗脱体积图。从图中可以看出，多肽分子是连续分布的，即水解物存在着各种分子量大小不等的肽分子。水解物中多肽主要分布在洗脱体积在100mL~250mL之间。三个不同水解时间的产物均有两个较为明显的吸收高峰。此外，更加明显的现象是随着时间的进行，第一个峰值逐渐减小而第二个峰值逐渐增加，说明前一峰分子量所对应的物质逐渐水解成后一峰所对应的物质，并且在这一过程中伴随着后峰前后小分子量物质的生成。当水解时间为2h时，洗脱峰有两个最高点出现在洗脱体积分别为90mL和190ml，此时由标准曲线可知分子量分别在31500Da和100－200Da左右。
3.结论
通过对燕麦麸皮中蛋白提取及水解工艺进行的研究，可以得出以下结论：
1) 实验中发现，碱提法因为在高碱条件下作用，会产生游离的单宁、釉质等物质，而这些物质在水解液中会发生褐变，生成有色物质，并附着于蛋白质分子上，使蛋白质颜色加深，是燕麦蛋白水解液最终呈现为黄褐色，而这种颜色不利于感官评价。因此，在实际生产中为改善蛋白质色泽，提高其品质，应对其进行脱色，
2) 碱法水解蛋白的水解度在30％左右。水解产物主要是对应分子量分别在31500Da和100－200Da左右的小分子物质。
3) 由于是在极碱条件下水解蛋白，使得水解液的风味不佳需要脱碱，调至中性后稍有改善。

参考文献
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